Книга: Ребриков Д. В., Коростин Д. О., Шубина Е. С., Ильинский В. В. «NGS»

Рассмотрены различные варианты и особенности современных методов определения структуры нуклеиновых кислот (методов секвенирования второго и третьего поколений). Описаны принципы наиболее популярных технологий высокопроизводительного секвенирования (NGS). Дана классификация высокопроизводительных методов секвенирования по нескольким параметрам. Приведены основные элементы первичного анализа данных масштабного секвенирования. Отдельные главы посвящены применению NGS для решения различных биологических задач: секвенирования про- и эукариотических геномов и транскриптомов, метагеномного секвенирования, использования NGS в медицинской практике.
Для сотрудников генно-инженерных и медицинских диагностических лабораторий, а также для преподавателей и студентов, специализирующихся в области молекулярной биологии и биотехнологии.

Содержание:

Предисловие Е. Д. Свердлова...... 7 Предисловие М. С. Гельфанда...... 8 Предисловие авторов...... 9 Перечень компаний, упомянутых в тексте...... 11 Список сокращений...... 12 Глава 1. Обзор методов определения последовательности нуклеиновых кислот...... 13 1. 1. Методы, основанные на детекции сигнала от множества одинаковых молекул ДНК (методы с предварительной амплификацией фрагментов ДНК)...... 14 1. 2. Методы, основанные на детекции сигнала от одной молекулы ДНК (секвенирование одиночных молекул ДНК)...... 34 1. 3. Другие методы секвенирования...... 40 Список литературы...... 40 Глава 2. Технологии создания библиотек фрагментов ДНК для NGS...... 43 2. 1. Очистка нуклеиновых кислот для NGS...... 45 2. 2. Оценка концентрации нуклеиновых кислот и полногеномная амплификация (WGA)...... 46 2. 3. Способы разрушения ДНК для приготовления библиотеки...... 47 2. 4. Оценка длин фрагментов ДНК...... 51 2. 5. Присоединение адаптеров...... 52 2. 6. Предварительная амплификация библиотеки...... 53 2. 7. Отбор фракции фрагментов нужной длины (size-select)...... 53 2. 8. Мечение смешиваемых образцов специфичными адаптерами («штрих-кодирование»)...... 56 2. 9. Клональная амплификация фрагментов ДНК...... 57 2. 10. Типы библиотек фрагментов ДНК для NGS...... 60 Список литературы...... 65 Глава 3. Коммерческие технологии высокопроизводительного секвенирования...... 66 3. 1. Технология 454 Life Sciences компании Roche (эмульсионная ПЦР + пиросеквенирование)...... 66 3. 2. Технология SOLiD компании Life Technologies Thermo Fisher Scientific (эмульсионная ПЦР + секвенирование лигированием)...... 69 3. 3. Illumina Genome Analyser компании Illumina (мостиковая ПЦР + секвенирование синтезом)...... 71 3. 4. Платформы Ion PGM и Ion Proton компании Life Technologies Thermo Fisher Scientific (эмульсионная ПЦР + полупроводниковое секвенирование)...... 74 3. 5. Платформа PacBio компании Pacific Biosciences (секвенирование синтезом одиночных молекул)...... 78 3. 6. Платформа Heliscope компании Helicos Biosciences (секвенирование синтезом одиночных молекул)...... 80 Список литературы...... 84 Глава 4. Общие принципы обработки данных NGS...... 85 4. 1. Оценка качества первичных данных...... 85 4. 2. Сборка геномов de novo...... 89 4. 3. Алгоритмы сборки...... 91 4. 4. Аппаратные и биологические особенности данных NGS...... 94 4. 5. Объединение контигов в скэффолды...... 97 4. 6. Вариации в близкородственных геномах...... 100 4. 7. Картирование прочтений при повторном секвенировании...... 101 4. 8. Поиск однонуклеотидного полиморфизма (SNP)...... 104 4. 9. Поиск структурных вариаций: протяженных вставок, делеций, инверсий и транслокаций...... 105 4. 10. Аннотация обнаруженных вариаций с использованием баз данных...... 106 4. 11. Предсказание функциональных и клинически значимых изменений белка на основе обнаруженных мутаций...... 107 Список литературы...... 108 Глава 5. Оборудование и программные решения для обработки данных NGS...... 112 5. 1. Локальные центры обработки данных NGS: архитектура и программные решения...... 112 5. 2. Программное обеспечение для локального центра обработки данных NGS...... 116 5. 3. Сетевые сервисы и простые решения для обработки данных NGS...... 117 5. 4. Специализированные проекты по обработке данных NGS...... 120 Список литературы...... 121 Глава 6. Планирование эксперимента с использованием NGS...... 122 6. 1. Общие принципы планирования биологических экспериментов...... 122 6. 2. Рандомизация в NGS...... 123 6. 3. Повторности в NGS...... 124 6. 4. Основные типы ошибок при секвенировании...... 125 6. 5. Варианты применения NGS...... 126 Список литературы...... 127 Глава 7. Секвенирование индивидуальных геномов и транскриптомов прокариот...... 128 7. 1. Роль NGS в микробиологии...... 128 7. 2. История секвенирования бактериальных геномов...... 129 7. 3. Определение полной последовательности бактериального генома de novo...... 130 7. 4. Пример протокола секвенирования образца бактериальной ДНК...... 132 7. 5. Анализ данных геномного секвенирования бактерий...... 141 7. 6. Секвенирование транскриптома прокариот...... 142 Список литературы...... 145 Глава 8. Исследование микробных сообществ методами NGS...... 146 8. 1. Очистка ДНК для метагеномных исследований...... 147 8. 2. Анализ микробного сообщества секвенированием ампликонов...... 148 8. 3. Метагеномное секвенирование...... 151 8. 4. Биоинформатический анализ данных метагеномного секвенирования...... 152 8. 5. Комбинированный алгоритм анализа таксономического состава сообщества...... 154 8. 6. Сравнение метагеномов между собой...... 155 8. 7. Метатранскриптом...... 155 Список литературы...... 157 Глава 9. Секвенирование геномов эукариот...... 162 9. 1. Общие аспекты секвенирования сложных геномов...... 162 9. 2. Секвенирование эукариотических геномов de novo...... 164 9. 3. Повторное секвенирование (ресеквенирование)...... 166 9. 4. Фазирование при ресеквенировании диплоидных геномов...... 169 9. 5. Секвенирование генома отдельной клетки...... 171 Список литературы...... 174 Глава 10. Секвенирование транскриптомов эукариот...... 176 10. 1. Применение NGS для исследования РНК...... 176 10. 2. Общие моменты очистки РНК и синтеза кДНК...... 178 10. 3. Ферменты для обратной транскрипции...... 180 10. 4. Подготовка библиотеки к ДНК для NGS...... 182 Список литературы...... 188 Глава 11. Повышение концентрации определенных последовательностей в библиотеке для NGS (таргетное секвенирование)...... 191 11. 1. Параметры методов целевого обогащения...... 191 11. 2. Обогащение библиотеки фрагментов ДНК только на основе ПЦР...... 192 11. 3. Обогащение библиотеки фрагментов ДНК при помощи гибридизации с пробой...... 198 11. 4. Обогащение при помощи гибридизации в растворе с отбором методом ПЦР (инвертированные молекулярные пробы)...... 201 11. 5. Обогащение библиотеки белок-связывающими последовательностями хроматина (ChIP-Seq)...... 203 Список литературы...... 206 Глава 12. Применение высокопроизводительного секвенирования в медицинской практике...... 207 12. 1. Генетическое тестирование с использованием NGS...... 207 12. 2. Исследование патогенов и микробиома человека...... 220 Список литературы...... 222 Глава 13. Перспективы высокопроизводительного секвенирования...... 223 Список литературы...... 227 Предметный указатель...... 228

Издательство: "БИНОМ. Лаборатория знаний" (2015)

ISBN: 9785996330249